Правила приготовления микропрепаратов. Лаборатория микроскопирования Что необходимо для приготовления микропрепарата

При изготовлении временных микропрепаратов необходимо соблюдать следующую последовательность операций:

• 1. Вымыть и тщательно вытереть предметное и покровное стекла. Чтобы не сломать очень хрупкое покровное стекло, надо поместить его в складку салфетки между большим и указательным пальцами правой руки и осторожно вытереть его круговыми движениями пальцев.
• 2. Нанести на предметное стекло пипеткой каплю жидкости (воды, глицерина, раствора, реактива или красителя).
• 3. Сделать срез изучаемого органа при помощи лезвия. Лезвие должно быть очень острым.
• 4. Выбрать самый тонкий срез, перенести его с помощью препаровальной иглы или тонкой кисточки в центр предметного стекла в каплю жидкости.
• 5. Закрыть срез покровным стеклом так, чтобы под него не попал воздух. Для этого покровное стекло взять двумя пальцами за грани и подвести под углом нижнюю грань к краю капли жидкости и плавно его опустить.
• 6. Если жидкости много, и она вытекает из-под покровного стекла, удалить ее при помощи фильтровальной бумаги. Если же под покровным стеклом остались места, заполненные воздухом, то добавить жидкость, поместив ее каплю рядом с краем покровного стекла, а с противоположной стороны фильтровальную бумагу .

Перед учителями биологии и руководителями кружков рано или поздно встает задача изготовить учебный микропрепарат. Какое же вещество, способное надолго зафиксировать биологический объект, и как сделать эту процедуру простой и доступной. Известные бальзамы (смолы-фиксаторы) никогда не относились к легкодоступным веществам, особенно в удалении от крупных городов. Кроме того, говорят, что вещества эти не безвредны. И, наконец, сам процесс их использования довольно непрост.

Для изготовления препарата можно использовать клей ПВА. Важно, чтобы препарат был влажный, хорошо смоченный, а клей - свежий и чуть разбавленный чистой холодной кипяченой водой до нужной концентрации (клей представляет собою эмульсию и легко разводится). После нескольких проб и ошибок нужную концентрацию получится составлять и определять без труда.

Затем, на чистое предметное стекло наносят каплю воды - кипяченой или дистиллированной. Воду надо аккуратно удалить чистой, не оставляющей волосков тканью или фильтровальной бумагой так, чтобы стекло было чуть влажным. Это, как и влажность образца, способствует равномерному (без пузырьков) смачиванию. На подготовленную поверхность нужно нанести небольшую каплю заранее приготовленного клея ПВА так, чтобы не появились пузырьки воздуха. Они иногда и не мешают, но внешний вид препарата портят. В эту каплю аккуратно переносят заранее подготовленный срез или образец, например, предварительно умерщвленную горячей водой дафнию. Затем плавным наклонным движением надо сверху положить покровное стекло, также чистое и слегка влажное. Слой клея между стеклами должен быть как можно более тонким.

Если что-то не удалось, а образец ценный и достаточно крупный, почти всегда, в отличие от смол, есть возможность его отмыть простой водой и процедуру повторить. Излишки клея аккуратно смываются тонкой струйкой воды; нужно следить, чтобы она не затекала между стеклами. Покровное стекло необходимо придерживать. Чуть мутноватые остатки воды можно аккуратно удалить фильтровальной бумагой или полоской тонкой ткани без ворса. биология микропрепарат приготовление способ

Готовые препараты надо разложить в теплом сухом месте. Индикатором готовности препарата служит его прозрачность. В зависимости от очень многих факторов высыхание до прозрачного состояния продолжается от одной до четырех недель. Бывает, что слишком толстый слой клея или клей, загрязненный примесями, полностью прозрачным не становится - это несколько ухудшает изображение, но благодаря небольшой глубине резкости микроскопа даже такие препараты доступны для изучения.

Нет гарантии, что этот метод можно применять для изготовления любых препаратов, поскольку некоторые из них требуют окрашивания, а красители могут взаимодействовать с клеем .

Т.Н. Лашкина, учитель биологии и экологии средней школы № 23, из г. Сызрань предлагает следующий способ приготовления микропрепаратов. Можно взять обыкновенный желатин, залить его водой для набухания. Затем в столовую ложку набрать немного набухшего желатина (без воды) и нагреть над огнем. Когда желатин разойдется (не надо, чтобы он закипал), капнуть его на предметное стекло. В эту каплю положить образец и закрыть покровным стеклом, хорошо придавить пальцем его для равномерного распределения желатина. Микропрепарат готов.

Вместо покровного стекла можно использовать целлофан, если нет покровных стекол. Кроме того, целлофан имеет одно преимущество: микропрепарат нельзя раздавить, т.к. целлофан эластичен и не трескается, как покровное стекло.

С желатином надо работать быстро, иначе он застывает. Но если такое случится, то достаточно подержать стекло над огнем - и желатин вновь станет жидким. Желатин безвреден, доступен и очень экономичен .

Министерство образования и науки РФ

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Шадринский государственный педагогический институт»

Кафедра естественнонаучных дисциплин с методикой преподавания

Способы приготовления микропрепаратов по биологии

Курсовая работа

по специальности 050102 «Биология»

Исполнитель:

Горшкова Екатерина Андреевна

Студентка 3 курса дневного отделения

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук, доцент

Шарыпова Надежда Владимировна

_________________________________

Оценка __________________________

Шадринск

2014

Введение ………………………………………………………………………….3

§ 1. Характеристика микропрепаратов и их использование ………………….4

§ 2. Оборудование, необходимое для приготовления микропрепаратов …….7

§ 3. Подготовка материала для приготовления микропрепаратов …………...12

§ 4. Способы приготовления микропрепаратов ……………………………….17

Заключение ………………………………………………………………………31

Библиографический список …………………………………………………….32

Приложение ……………………………………………………………………...34

Введение

Актуальность темы исследования . Микропрепараты являются наглядным средством обучения и поэтому их широко используют на уроках биологии во время лабораторных занятий, при изучении нового материала, обобщениях, сопоставлениях и опросе.

В связи с недостаточным обеспечением кабинетов биологии готовыми микропрепаратами, которые необходимы для лучшего изучения предмета, их можно изготовить самостоятельно.

Исходя из актуальности, мы выбрали следующую тему исследования: «Способы приготовления микропрепаратов по биологии».

Объектом исследования являются микропрепараты.

Предмет – способы приготовления микропрепаратов.

Цель исследования : изучить виды микропрепаратов по биологии и способы их приготовления.

Задачи исследования:

1. Изучить и проанализировать литературу по данной теме.
2. Дать характеристику микропрепаратов и советы по их использованию на уроках биологии.
3. Описать оборудование, необходимое для приготовления микропрепаратов.
4. Научиться подготавливать материал для приготовления микропрепаратов.
5. Изучить способы приготовления микропрепаратов.

Для реализации целей и задач использовали следующие методы исследования: анализ научно-методической литературы по теме исследования, опытно-поисковая работа и обобщение ее результатов.

Структура курсовой работы . Курсовая работа состоит из введения, 4 параграфов и заключения, представлен библиографический список, включающий 16 источников, 1 приложения.

§ 1. Характеристика микропрепаратов и их использование

К натуральным препарированным пособиям относятся гербарии, влажные препараты, микропрепараты.

Микропрепарат, представляет собой тонкий срез органа живого организма или микрочастицу, заключенный в прозрачный бальзам (иммерсионное масло) или высушенный, помещенный между двумя стеклами (предметным и покровным) .

Происхождение микропрепаратов берет начало в использовании слоновой кости или обычной кости в качестве подставки под образцы, которые помещались между дисками прозрачной слюды. Подобная конструкция была популярной в викторианской Англии, пока Королевское Микроскопическое Общество не представило стандартизированное предметное стекло для микроскопа .

Микропрепараты позволяют демонстрировать внутреннее клеточное строение организмов, что помогает формированию у учащихся знаний о едином клеточном строении организмов. Микропрепараты можно разделить на две группы:

• постоянные, изготовленные фабричным путем специально для обучения;
• временные, приготовленные учителем для урока или на уроке самими школьниками однократного пользования.

Постоянные микропрепараты представляют собой тончайшие срезы тканей организмов, их органов. Клетки в большинстве своем не имеют окраски и потому, даже при большом увеличении микроскопа, бывает трудно рассмотреть внутриклеточные структуры, в том числе ядро. В связи с этим клеточные микропрепараты окрашивают специальными красителями для придания им большей наглядности. Учителям обязательно надо предупреждать детей о том, что цвет не является естественным для микроструктур. Используют их при изучении нового материала, обобщениях, сопоставлениях и опросе.

Временные препараты так называются потому, что не сохраняются долго. После ознакомления с микрообъектом временный препарат смывается с предметного стекла. Приготовление микропрепарата - один из обязательных видов умений, формируемых в курсе биологии, начиная с 6 класса .

Для изучения живых клеток микроорганизмов применяют препараты “раздавленная капля”, “висячая капля”, “отпечаток”, “агаровая пленка” (“микрокультура”). Препараты живых клеток рассматривают с “сухими системами ” микроскопа. Препараты, работа с которыми уже закончена, прежде чем вымыть, выдерживают в дезинфицирующем растворе .

Микропрепараты позволяют проводить широкий ряд опытов, предусмотренных программой школьного курса биологии. Они предназначены для детального изучения микроскопических структур под микроскопом.

Преподаватель до работы с микропрепаратом должен четко объяснить учащимся, что они должны увидеть, используя таблицы, рисунки, схемы и т. п.

Во время опроса преподаватели нередко используют «немые», (без этикеток) микропрепараты. Учащимся дается задание определить микропрепараты, рассказать о строении той или иной ткани. Целесообразно хранить одинаковые микропрепараты в одной упаковке, чтобы можно было быстро раздать их учащимся.

Микропрепараты хранят вдали от отопительных приборов и так, чтобы предметное стекло находилось в горизонтальном положении для предотвращения «сползания» микропрепарата .

Требования к микропрепаратам:

1. Стекла должны быть бесцветными и прозрачными. Покровное стекло должно быть тоньше предметного, которое служит основой изделия.
2. Микропрепарат должен быть центрирован, т.е. расположен в середине покровного стекла. Местоположение очень мелкого объекта должно быть отмечено рамкой.
3. Микроскопические срезы должны быть очень тонкими и иметь все необходимые для изучения элементы.
4. Отдельные ткани микропрепарата должны быть окрашены ярким стойким красителем.
5. Микропрепараты должны выпускаться в виде набора для каждого раздела курса биологии. Количество одноименных препаратов в наборе должно быть достаточным для проведения лабораторной работы всеми обучающимися в классе (15-20 шт.).
6. К набору микропрепаратов должны быть приложены методические рекомендации, где должны быть приведены рисунки изучаемых микрообъектов и задания для самостоятельной работы учащихся .

Изучение микропрепаратов в процессе обучения приобщает к методам науки, дает возможность путем непосредственного наблюдения увидеть строение организмов, их частей.

Микропрепараты представляют собой микроскопически малые живые объекты, тончайшие срезы их органов и частей. Эти объекты заключены между покровным и предметным стеклами в специальном растворе. Для лучшей различимости препараты окрашивают, поэтому окраска объектов искусственная.

1. Да начала работы с микропрепаратом требуется записать его название, тему лабораторного занятия.

2. Изучение любого микропрепарата начинают с рассматривания под микроскопом при малом увеличении (56х). Затем выбирают место, где детали лучше видны, и ставят большое увеличение (120-300х) и приступают к зарисовке. При зарисовке микропрепарата надо соблюдать соотношение размерах отдельных частей оригинала. Зарисовка помогает лучше запомнить и создать зрительное представление об объекте.

3. Сначала на рисунке обозначают основные элементы, затем дополняют деталями. Под рисунком подписывают название микропрепарата и увеличение, при котором выполнен рисунок. На одной странице ученической тетради делают 2-3 рисунка. Основные структуры микропрепарата обозначают указателями и напротив каждой пишут цифру с последующей их расшифровкой. Контур поля зрения микроскопа не обозначают .

Таким образом, существует 2 вида микропрепаратов – временные и постоянные. Их отличие состоит во времени хранения и способах приготовления. Микропрепараты должны отвечать определенным требованиям, которые необходимо тщательно соблюдать. Для приготовления микропрепаратов необходимо специальное оборудование, которое описано в следующем параграфе.

§ 2. Оборудование, необходимое для приготовления микропрепаратов

Рабочий стол.

При отсутствии специального стола с успехом может быть приспособлен любой стол (желательно с ящиками) с площадью рабочей поверхности не менее 60*120см.

Если крышка стола не имеет специального покрытия, то его следует сделать из какого-либо влагоустойчивого материала. Однако участок стола, предназначенный для непосредственной работы по приготовлению препаратов, в любом случае необходимо накрыть стеклом и расположить под ним небольшие (9*12см) листы белой или черной бумаги. Этим создается соответствующий фон, облегчающий работу с окрашенными (белый лист) и не окрашенными (черный лист) объектами. Рекомендуется также на оба листа нанести контуры предметного стекла с обозначением места расположения и размеров покровного стекла.

Для того, что бы удобнее расположить необходимое оборудование, следует иметь двухъярусную полку для реактивов, растворов и посуды, которая устанавливается либо перед работающим (вдоль заднего края стола), либо сбоку в зависимости от расположения стола относительно источника света.

Лабораторная посуда.

Широкогорлые банки с притертыми пробками различной вместимости от 50 до 200 мл – используют для составления гистологических батарей, предназначенных для подготовки кусочков тканей к заливке различными средами. Более крупные банки применяют для фиксации и хранения кусочков тканей в фиксирующих жидкостях, обработки предметных стекол, приготовление нейтрального формалина и пр.

В место банок с притертыми пробками можно использовать небольшие хозяйственные банки с жестяными завинчивающимися крышками, разного объема.

Бюксы — небольшие круглые стеклянные стаканчики различного диаметра и высоты с шлифованными крышками.

Биологические стаканчики — круглые, овальные или четырехугольные (как и высокие бюксы) применяют для проводки гистологических срезов, монтированных на предметных стеклах. Для придания устойчивости и обеспечения порядка в расстановке их помещают в специальные стойки, изготовленные из дерева или пластмассы, по несколько штук в ряд в зависимости от методики обработки.

Чашки Петри — широкие, плоские стеклянные чашки с крышками – пригодны для различных манипуляций (окраска свободно плавающих и наклеенных на предметные стекла срезов, использование в качестве подставок под бюксы и т.д.).

Мерная посуда – цилиндры и мензурки различной емкости (от 10 до 250-500 мл) воронки различных размеров.

Химические стаканчики — круглые стеклянные стаканчики без крышек вместимостью 50-100 мл – находят широкое применение при проведении гистохимических реакций, окраски срезов наклеенных на стекла и т.д.

Колбы (плоскодонные) – вместимостью от 50 мл до 2 л. Малые колбы применяют для приготовления и хранения растворов различных красителей, большие — под дистиллированную воду и прочие жидкости, расходуемые в больших количествах.

Пипетки обычные (предназначенные для закапывания лекарств) используют для накапывания на срезы красителей и различных жидкостей, градуированные (вместимостью 0,1-100 мл) применяют для отмеривания малых количеств различных жидкостей. Можно использовать в настоящее время широко используемые автоматические пипетки различной вместительности.

Предметные стекла – прямоугольные пластины размером 76*25 мм толщиной 1,2-1,4 мм, предназначенные для размещения срезов в процессе приготовления микропрепаратов . Более толстые стекла не позволяют получить резкое изображение краев диафрагмы осветителя в плоскости препарата, так как оно оказывается в толще стекла, а это нарушает фокусировку конденсора и резко снижает четкость изображения .

Покровные стекла – представляют собой тонкие (0,15-0,17 мм толщины, более толстые стекла ухудшают качество изображения) пластинки различных размеров. Служат для покрытия обработанных срезов, расположенных на предметных стеклах. Размеры покровных стекол выбирают в зависимости от площади объекта.

Инструменты.

Инструменты, используемые в гистологической лаборатории, включают в себя пинцеты, скальпели, кровоостанавливающие зажимы, корнцанг, бактериологические петли шпатели, препаровальные иглы – прямые и изогнутые, металлические и стеклянные. Стеклянные иглы необходимы при импрегнации серебром, когда металлические иглами пользоваться нельзя.

Так же необходимо иметь спиртовку, волосяную кисточку для снятия срезов с микротомного ножа, фильтровальную бумагу, иголки, нитки, плотную бумагу для этикетирования материала, лейкопластырь и карандаш по стеклу .

Подготовка предметных стекол.

Предметные стекла, применяемые для получения гистологических препаратов, необходимо предварительно подготовить. Исключение составляют готовые к использованию и специально упакованные импортные предметные стекла.

Предметные стекла моют в теплой мыльной воде или кипятят 15 минут в 2-3 % растворе гидрокарбоната натрия, затем ополаскивают горячей водой и промывают в течение нескольких часов в проточной воде. Вымытые стекла протирают чистой хлопчатобумажной тканью и на несколько дней помещают в 96 % спирт. Обезжиренные стекла извлекают пинцетом из этой смеси, протирают чистой тканью и складывают в коробочку.

Предметные стекла также хорошо обезжириваются в крепком растворе соляной кислоты. Через несколько суток их промывают проточной водой и высушивают.

Качество обезжиривания можно проверить, капнув на предметное стекло воду из пипетки: по обезжиренному стеклу вода растекается тонким слоем, а не собирается в каплю.

Для лучшей фиксации срезов на стекле его предварительно смазывают смесью белка с глицерином. Свежий яичный белок взбивают и фильтруют через крупнопористый фильтр, смоченный дистиллированной водой, затем размешивают с равным объемом глицерина и добавляют несколько кристаллов тимола. Смесь хранится в течение нескольких месяцев. Применяют также смесь, в состав которой входят 15 мл сыворотки крови, 5 мл дистиллированной воды и 6 мл 5 %-ного формалина. После фильтрации смесь готова к нанесению на предметные стекла. Ее использование дает лучшие результаты, чем применение яичного белка, так как при окрашивании не образуется фон.

Для нанесения белка на обезжиренные предметные стекла в одну руку берут 5-6 стекол в виде веера, а в другую — чистую стеклянную палочку, которой наносят белок, прикасаясь к каждому стеклу. Затем белок растирают обезжиренным спиртом пальцем по поверхности стекла до его середины, прилагая небольшое усилие. Некоторые авторы рекомендуют натертые белком стекла прогревать в термостате, но опыт показывает, что это излишне, так как после переноса срезов на стекла их помещают в термостат или на специальный столик для просушивания, где одновременно происходит коагуляция белка.

Разработан способ фиксации среза к предметному стеклу без предварительного натирания последнего белком с глицерином.

В ванночку с теплой дистиллированной водой капают несколько капель жидкого казеинового клея и перемешивают. В полученную мутноватую жидкость опускают срезы, расправляют препаровальной иглой и вылавливают на чистое обезжиренное стекло.

Этот способ дает неизменно хороший эффект и вокруг среза отсутствует окрашенный фон, как это часто бывает при применении белка .

Таким образом, для приготовления микропрепаратов требуется специальное оборудование и инструменты. Основными из них являются предметное и покровное стекла. Прежде чем начать готовить микропрепарат, необходимо правильно подготовить предметные стекла. К их хранению также предъявляются специальные требования. Но подготовки одного оборудования не достаточно для приготовления микропрепаратов, необходимо также подготовить материалы для исследования. Подробно об этом говорится в следующем параграфе.

§ 3. Подготовка материала для приготовления микропрепаратов

Микропрепараты делятся на временные и постоянные. Подготовка материала для временных препаратов включает фиксацию и окраску.

Фиксация – это процесс быстрой консервации клеточных структур, при котором все физиолого-биохимические процессы останавливаются, а водорастворимые вещества переходят в нерастворимое состояние. Следовательно, фиксация позволяет сохранить внутриклеточные структуры в неизменном виде на длительное время. Однако при фиксации в клетках могут появляться артефакты – новые структуры, которые отсутствуют в живой клетке, например, разнообразные вакуоли. Для предотвращения появления артефактов необходимо использовать специально подобранные химические растворы – фиксаторы, а сама фиксация должна проводиться в определенных условиях. В частности, желательно использовать охлажденные фиксаторы (до 2-3 градусов); для фиксации нужно брать отдельные клетки или кусочки тканей не толще 5мм; объем фиксатора должен превышать объем фиксируемого материала в 50-100 раз; фиксатор не должен использоваться для длительного хранения материала; фиксатор не должен использоваться повторно.

Рассмотрим состав и применение наиболее широко распространенных фиксаторов.

Формалин (формальдегид, или муравьиный альдегид). Наиболее простой и широко распространенный фиксатор. Применяется в виде водных растворов с концентрацией 4-10 %, при этом за 100 % принимается концентрация продажного формалина. Продажный формалин содержит примесь муравьиной кислоты, которую нейтрализуют с помощью углекислого кальция в течение 24 часов. Время фиксации от 1 часа до 24 часов. Для длительного хранения материал переносят в свежий 10 %-ный формалин. Чистый формалин используют в том случае, если планируется дальнейшее изучение локализации и активности ферментов. Чаще же формалин включается в рецептуру более сложных фиксаторов.

Спиртовые фиксаторы. Содержат этиловый или метиловый спирт. Водные растворы спиртов в чистом виде (70 %, 96 % или 100 %) используются относительно редко. Чаще применяют 100 %-ные спирты, которые смешивают с другими веществами. Нужно иметь в виду, что метиловый спирт (метанол) и его пары – ядовиты.

В качестве универсальных фиксаторов используют различные композиции на основе формалина, спиртов, органических кислот и неорганических веществ.

Уксусный алкоголь (ацеталкоголь). Это один из наиболее простых фиксаторов. Состоит из 3 частей абсолютного спирта (этилового, а лучше – метилового) и 1 части ледяной уксусной кислоты. Для приготовления 100 %-ного (абсолютного) спирта исходные спирты обезвоживают. Для обезвоживания этилового спирта (этанола) используют безводный сульфат меди, а для обезвоживания метилового спирта (метанола) – используют оксид кальция. Хранят их в герметичной посуде. Нужно иметь в виду, что все абсолютные спирты особенно ядовиты. Для приготовления ледяной уксусной кислоты исходную концентрированную кислоту охлаждают в холодильнике; при этом кислота замерзает, раньше, чем вода. Жидкость сливают, а замерзшую кислоту оттаивают и используют для приготовления фиксатора. Фиксатор готов для употребления через 24 часа. Хранить фиксатор в темном холодном месте. Время фиксации – 2...24 часа. Затем материал переносят в свежий фиксатор, в котором он может храниться до 1 месяца в холодильнике. Для более длительного хранения материал переносят в 70 %-ный спирт .

Фиксатор Карнуа. Состав – абсолютный спирт – 10 см 3 ; хлороформ – 3 см 3 ; уксусная кислота – 1 см 3 . Срок фиксации 1-3 часа .

Фиксаторы, содержащие пикриновую кислоту, например, смесь Буэна – 15 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты: 5 частей формалина: 1 часть ледяной уксусной кислоты. Этот фиксатор готовят непосредственно перед употреблением. Время фиксации от 1 до 24 часов (иногда несколько суток). Фиксированный материал хранят в 70 %-ном спирте.

Фиксаторы, содержащие сулему (хлорид ртути (II) – HgCl 2 ). Сулема используется в виде насыщенного водного раствора в смеси с ледяной уксусной кислотой (25:1), формалином (8,5:1) и более сложных композиций (фиксатор «Суза», фиксатор Ценкера и др.). Время фиксации от 1 до 24 часов. Затем сулему удаляют спиртовым раствором йода (6 частей 70 %-ного спирта:1 часть йодной настойки), а йод удаляют 70 %-ным спиртом. Фиксированный материал хранят в 70 %-ном спирте.

Фиксаторы, содержащие осмий (четырехокись осмия, или осмиевая кислота). Дают наилучшие результаты, используются при изготовлении препаратов, как для световой, так и электронной микроскопии. Можно использовать 1-2%-ный раствор осмиевой кислоты, но чаще применяют композиции, например, фиксатор Флеминга – 15 частей 2 %-ной осмиевой кислоты: 1 часть ледяной уксусной кислоты. Фиксация протекает медленно (от 24 часов до нескольких суток).

Кроме перечисленных фиксаторов общего назначения, существуют и специальные фиксаторы. Например, фиксатор для митохондрий содержит 4 части 3 %-ного раствора дихромата калия и 1 часть 40 %-ного формалина. Фиксатор для хлоропластов содержит 15 частей насыщенного раствора медного купороса, 1 часть 40 %-ного формалина и 5 частей воды.

В ряде случаев вместо химической фиксации применяется быстрое замораживание образцов, например, при температуре жидкого азота (–196 0 ) или при температуре сухого льда (–78 0 ). Замороженные объекты могут быть обезвожены путем возгонки воды в вакууме при температуре ниже –40 0 (этот процесс называется лиофилизация).

Окрашивание позволяет выявлять внутриклеточные структуры, обладающие повышенным сродством к определенным красителям. Красители – это относительно низкомолекулярные органические вещества, обладающие повышенным сродством к определенным химическим компонентам клетки.

Существует множество красителей, которые используются для различных целей. Нужно иметь в виду, что выбор красителя связан с характером фиксации и различными методами предварительной обработки клеток.

Названия красителей могут соответствовать получаемой окраске (рубин, кармин, метиловый синий, метиленовый синий, генциановый фиолетовый, метиловый зеленый, оранжевый золотой). Иногда русские названия цветов заменяют на немецкие, например: метилблау, генцианвиолет. В других случаях названия носят отвлеченный, исторически сложившийся характер, например: пиронин, фуксин, сафранин, флороглюцин, судан III. Иногда название красителя не соответствует полученной окраске, например, синий тионин дает фиолетово-красное окрашивание. Довольно редко применяются химические номенклатурные названия красителей, например: диметиламинобензальдегид, 8-амино-1-нафтол-5-сульфокислота.

Различают основные (щелочные), кислотные и нейтральные красители. Основные красители избирательно окрашивают базофильные клеточные структуры (то есть структуры с кислотными свойствами). Кислотные красители избирательно окрашивают ацидофильные, или оксифильные клеточные структуры (то есть структуры со щелочными свойствами). Нейтральные красители окрашивают и базофильные, и ацидофильные структуры.

Наименее токсичные красители используются для прижизненной окраски клеток. Эти красители обычно применяют в виде водных растворов, например: метиленовый синий (концентрация от 1:1000 до 1:10000), трипановый синий (0,5 %-ный раствор), нейтральный красный (от 1:50000 до 1:200000).

Красители для фиксированных клеток могут использоваться в чистом виде (водные или спиртовые растворы, концентрация от 0,1 % до 1 %), например: эозин, фуксин. Часто используют смеси красителей, например, смесь Романовского–Гимза (содержит метилен–азур, метиленовый фиолетовый, метиленовый синий и эозин), окраска по Маллори (последовательное использование кислотного фуксина S, а затем смеси анилинового синего и оранжевого золотого G), азур–эозин, метилблау–эозин.

Однако чаще краситель образуется в ходе его приготовления. Например, широко известное вещество растительного происхождения гематоксилин становится красителем только после его окисления до гематеина. Для окрашивания ядер и хромосом широко используются красители в сочетании с органическими кислотами. Рассмотрим методики приготовления некоторых наиболее простых красителей.

Приготовление 2 %-ного ацетофуксина. 1 грамм основного фуксина растворяют в 50 мл 40 %-ной уксусной кислоты при подогревании на водяной бане.

Приготовление 1 %-ного ацеторсеина. К 1 грамму орсеина добавляют 50 мл ледяной уксусной кислоты и настаивают около 12 часов. Затем смесь нагревают до кипения и добавляют 50 мл дистиллированной воды. Затем нагревают до кипения и охлаждают, повторяя эту процедуру 10 раз. Через сутки краситель фильтруют. Перед окрашиванием на 9 частей красителя добавляют 1 часть 1 н. HCl.

Приготовление 4 %-ного ацетокармина. Раствор готовят в термостойкой колбе с водяным холодильником. 4 грамма ацетокармина смешивают с 100 мл 50 %-ной уксусной кислоты, и кипятят 1 час. Через сутки краситель фильтруют. Аналогичным образом приготавливается ацетолакмоид.

Вместо уксусной кислоты часто используют другие органические кислоты, например, 40 %-ную молочную кислоту.

Все красители после приготовления фильтруют и хранят в темном прохладном месте. Время окрашивания препаратов зависит от температуры (обычно от 20 минут до 1 суток). При нагревании или кипячении время окрашивания сокращается.

Кроме окрашивания органическими красителями отдельные структуры можно выделить, используя их импрегнацию серебром и другими металлами .

Таким образом, при приготовлении некоторых временных микропрепаратов необходима фиксация и окраска исследуемого материала. Благодаря этому можно лучше рассмотреть объект под микроскопом. Конкретно о способах приготовления микропрепаратов мы расскажем в четвертом параграфе.

§ 4. Способы приготовления микропрепаратов

При изготовлении временных микропрепаратов необходимо соблюдать следующую последовательность операций:

1. Вымыть и тщательно вытереть предметное и покровное стекла. Чтобы не сломать очень хрупкое покровное стекло, надо поместить его в складку салфетки между большим и указательным пальцами правой руки и осторожно вытереть его круговыми движениями пальцев.

2. Нанести на предметное стекло пипеткой каплю жидкости (воды, глицерина, раствора, реактива или красителя).

3. Сделать срез изучаемого органа при помощи лезвия. Лезвие должно быть очень острым.

4. Выбрать самый тонкий срез, перенести его с помощью препаровальной иглы или тонкой кисточки в центр предметного стекла в каплю жидкости.

5. Закрыть срез покровным стеклом так, чтобы под него не попал воздух. Для этого покровное стекло взять двумя пальцами за грани и подвести под углом нижнюю грань к краю капли жидкости и плавно его опустить.

6. Если жидкости много, и она вытекает из-под покровного стекла, удалить ее при помощи фильтровальной бумаги. Если же под покровным стеклом остались места, заполненные воздухом, то добавить жидкость, поместив ее каплю рядом с краем покровного стекла, а с противоположной стороны фильтровальную бумагу .

Перед учителями биологии и руководителями кружков рано или поздно встает задача изготовить учебный микропрепарат. Какое же вещество, способное надолго зафиксировать биологический объект, и как сделать эту процедуру простой и доступной. Известные бальзамы (смолы-фиксаторы) никогда не относились к легкодоступным веществам, особенно в удалении от крупных городов. Кроме того, говорят, что вещества эти не безвредны. И, наконец, сам процесс их использования довольно непрост.

Для изготовления препарата можно использовать клей ПВА. Важно, чтобы препарат был влажный, хорошо смоченный, а клей – свежий и чуть разбавленный чистой холодной кипяченой водой до нужной концентрации (клей представляет собою эмульсию и легко разводится). После нескольких проб и ошибок нужную концентрацию получится составлять и определять без труда.

Затем, на чистое предметное стекло наносят каплю воды – кипяченой или дистиллированной. Воду надо аккуратно удалить чистой, не оставляющей волосков тканью или фильтровальной бумагой так, чтобы стекло было чуть влажным. Это, как и влажность образца, способствует равномерному (без пузырьков) смачиванию. На подготовленную поверхность нужно нанести небольшую каплю заранее приготовленного клея ПВА так, чтобы не появились пузырьки воздуха. Они иногда и не мешают, но внешний вид препарата портят. В эту каплю аккуратно переносят заранее подготовленный срез или образец, например, предварительно умерщвленную горячей водой дафнию. Затем плавным наклонным движением надо сверху положить покровное стекло, также чистое и слегка влажное. Слой клея между стеклами должен быть как можно более тонким.

Если что-то не удалось, а образец ценный и достаточно крупный, почти всегда, в отличие от смол, есть возможность его отмыть простой водой и процедуру повторить. Излишки клея аккуратно смываются тонкой струйкой воды; нужно следить, чтобы она не затекала между стеклами. Покровное стекло необходимо придерживать. Чуть мутноватые остатки воды можно аккуратно удалить фильтровальной бумагой или полоской тонкой ткани без ворса.

Готовые препараты надо разложить в теплом сухом месте. Индикатором готовности препарата служит его прозрачность. В зависимости от очень многих факторов высыхание до прозрачного состояния продолжается от одной до четырех недель. Бывает, что слишком толстый слой клея или клей, загрязненный примесями, полностью прозрачным не становится – это несколько ухудшает изображение, но благодаря небольшой глубине резкости микроскопа даже такие препараты доступны для изучения.

Нет гарантии, что этот метод можно применять для изготовления любых препаратов, поскольку некоторые из них требуют окрашивания, а красители могут взаимодействовать с клеем .

Т.Н. Лашкина, учитель биологии и экологии средней школы № 23, из г. Сызрань предлагает следующий способ приготовления микропрепаратов. Можно взять обыкновенный желатин, залить его водой для набухания. Затем в столовую ложку набрать немного набухшего желатина (без воды) и нагреть над огнем. Когда желатин разойдется (не надо, чтобы он закипал), капнуть его на предметное стекло. В эту каплю положить образец и закрыть покровным стеклом, хорошо придавить пальцем его для равномерного распределения желатина. Микропрепарат готов.

Вместо покровного стекла можно использовать целлофан, если нет покровных стекол. Кроме того, целлофан имеет одно преимущество: микропрепарат нельзя раздавить, т.к. целлофан эластичен и не трескается, как покровное стекло.

С желатином надо работать быстро, иначе он застывает. Но если такое случится, то достаточно подержать стекло над огнем – и желатин вновь станет жидким. Желатин безвреден, доступен и очень экономичен .

Приготовление срезов растений

Для изготовления срезов объект берут большим и указательным пальцами левой руки и при помощи скальпеля или ножа выравнивают его поверхность. В правую руку берут лезвие или бритву и делают им плавное быстрое движение по объекту к себе и вправо (см. приложение рис. 1, А). Срезы должны быть небольшие и тонкие. Их снимают с лезвия мягкой кисточкой и переносят на предметное стекло в каплю среды (см. приложение рис. 1, Б).

Для изготовления срезов мелких объектов последние помещают в сердцевину бузины (см. приложение рис. 2), предварительно сделав в ней разрез или углубление, и проделывают вышеописанную операцию. Лезвие, используемое для получения срезов должно быть острым (должно легко перерезать волос) .

Микропрепараты по ботанике

Препарат среза эпидермы с нижней стороны листа традесканции виргинской в капле воды.

Для изготовления препарата лист традесканции обвернуть вокруг указательного пальца левой руки так, чтобы нижняя сторона фиолетового цвета была обращена наружу. Правой рукой при помощи препаровальной иглы надорвать эпидерму над средней жилкой в средней части листа и пинцетом снять ее кусочек. При этом невольно захватывается и часть мякоти листа (мезофилла), но обычно можно найти тонкий участок на периферии, состоящий из одного ряда клеток эпидермы. Сорванный кусочек положить на предметное стекло в каплю воды наружной стороной вверх и накрыть покровным стеклом .

Препарат клеток листа элодеи канадской.

В верхней части побега элодеи при помощи пинцета оторвите лист и перенесите в каплю воды на предметное стекло. Лист следует положить нижней стороной к предметному стеклу.

Препарат хромопластов в клетках зрелых плодов.

При помощи препаровальной иглы возьмите маленькие кусочки мякоти зрелых плодов ландыша, рябины и шиповника. Поместите каждый кусочек в каплю воды на предметное стекло и аккуратно разделите клетки. Накройте покровным стеклом.

Препарат крахмальных зерен картофеля.

Разрежьте клубень картофеля. Со свежесрезанной поверхности возьмите скальпелем небольшое количество выступившей жидкости и перенесите в каплю воды на предметное стекло, накройте покровным стеклом.

Препарат каменистых клеток околоплодника груши.

На срезе свежего или фиксированного спиртом околоплодника груши найдите группу каменистых клеток, извлеките их. Поместите на предметное стекло и раздавите кончиком скальпеля.

Нанесите на каменистые клетки каплю 1 %-ного раствора флороглюцина в 50 %-ном этаноле, затем добавьте несколько капель концентрированной соляной кислоты (при работе с концентрированной кислотой следует соблюдать правила техники безопасности).

Одревесневшие оболочки приобретут вишнево-красный или малиновый цвет.

После появления окрашивания удалите реактив фильтровальной бумагой, добавьте каплю глицерина и накройте препарат покровным стеклом .

Препарат устьиц клеток растения.

Приготавливают несколько срезов нижней эпидермы листа и помещают их на 2 часа в 5 %-ный раствор глицерина. Срезы помещают на предметное стекло в том же растворе. Рассматривают препарат.

Затем заменяют глицерин на воду, оттягивая его из-под стекла фильтровальной бумагой. Смотрят, что изменилось.

После этого воду заменяют 20%-ным раствором глицерина или 1М раствором сахарозы. Наблюдают изменения (см. приложение рис. 3) .

Приготовление микропрепаратов по зоологии

Приготовление препарата простейших организмов сенного настоя.

С помощью стеклянной палочки поместите на предметное стекло каплю раствора метилцеллюлозы.

Пипеткой капните в этот раствор сенный настой. Накройте каплю покровным стеклом. Рассмотрите под микроскопом [ 6 ] .

Приготовление микропрепаратов по физиологии человека

Препарат мазка крови для исследования лейкоцитарной формулы. Каплю крови наносят на сухое предметное стекло (см. приложение рис. 4, а). Шлифовальное стекло устанавливают под углом 45° к предметному. Кровь при соприкосновении со шлифовальным стеклом растекается по его краю (см. приложение рис. 4, б). После этого быстрым движением шлифовальное стекло продвигают вперед, скользя по поверхности предметного стекла. При этом кровь тонким равномерным слоем размазывается по предметному стеклу (см. приложение рис. 4, в).

Хорошо приготовленный мазок крови выглядит на просвет желтоватым, равномерным и прозрачным. В этом случае форменные элементы крови располагаются в нем в один слой .

Приготовление микропрепаратов по микробиологи

Приготовление препаратов мертвых клеток микроорганизмов.

Для детального изучения микроорганизмов применяют фиксированные микропрепараты. При фиксации микробов убивают и затем окрашивают.

Приготовление фиксированных препаратов складывается из следующих операций: приготовление мазка, высушивание препарата, его фиксация, окраска и просушивание.

1 этап: Техника приготовления мазков (см. приложение рис. 5).

1. Приготовление мазка с плотной питательной среды

• на обезжиренное предметное стекло наносят петлей небольшую каплю физиологического раствора;
• в правую руку берут бактериологическую петлю, в левую – пробирку с культурой;
• петлю стерилизуют, внося ее в пламя горелки в вертикальном положении (накаливание докрасна) (см. приложение рис. 5-1);
• вынимают пробку из пробирки, захватив ее мизинцем правой руки, и обжигают на спиртовке край пробирки (см. приложение рис. 5-2,3);
• петлю вносят в пробирку, охлаждают ее, прикасаясь к стенкам, после чего с поверхности среды снимают небольшое количество культуры (см. приложение рис. 5-4);
• петлю вынимают, не касаясь стенок пробирки, обжигают края пробирки над спиртовкой и закрывают пробкой (см. приложение рис. 5-5,6);
• захваченную микробную культуру вносят в каплю физиологического раствора, тщательно размешивают и равномерно распределяют по стеклу в виде овала, круга или квадрата площадью 1-1,5см 2 (см. приложение рис. 5-7);
• по окончании приготовления мазка петлю вновь стерилизуют (см. приложение рис. 5-8).

1. При изготовлении мазка из культур с жидких питательных сред на предметное стекло наносят 1-3 петли исследуемого материала и равномерно распределяют по нему; при этом использование физиологического раствора не требуется. Далее поступают как описано выше.

2 этап: Высушивание мазков.

Приготовленный мазок высушивают на воздухе, над пламенем горелки (но не в пламени), в потоке теплого воздуха или в термостате.

Необходимо знать, что нагревание может нарушить структуру микробов, а так же то, что не до конца высушенный препарат при фиксации окажется испорченным.

3 этап: Фиксация мазков.

Различают физический и химический методы. При фиксации физическим методом стекло с мазком, обращенным кверху, медленно проводят 3-4 раза через пламя. При этом микроорганизмы погибают, мазок прикрепляется к стеклу и не смывается. С недофиксированного мазка микробы смываются, в перефиксированном наблюдается деструкция микроорганизмов, то есть распад на отдельные фрагменты.

Фиксация химическим методом достигается погружением мазков в фиксирующую жидкость, которой может служить:

Спирт (15-20 мин)

Спирт-эфир (10-15 мин)

Метиловый спирт (5 мин)

Хлороформ (несколько секунд)

Охлажденный ацетон (5 мин)

4 этап: Окраска мазков.

Окраска микроорганизмов имеет большое диагностическое значение. Она представляет собой сложный физико-химический процесс, в механизме которого существенную роль играют явления адсорбции, капиллярности, химического сродства между красителями и окрашиваемым объектом, рН среды, в которой они находятся.

Различают простые (ориентировочные) и сложные (дифференциальные) методы окраски микроорганизмов.

Простая окраска.

Простая окраска бактерий выявляет только их морфологию (форму, размер и взаимное расположение микробов). Обычно употребляется только один краситель (метиленовый синий или генциановый фиолетовый). Выделяют позитивный и негативный методы окрашивания.

Позитивный:

• Приготовленный и фиксированный мазок помещают в специальный мостик над ванночкой.
• Наносят какой-либо краситель на определенное время (количество краски должно быть таким, чтобы покрыть всю поверхность мазка, достаточно нескольких капель). При этом необходимо следить, чтобы краситель на мазке не подсыхал, в случае необходимости на мазок наливают новые порции красителя.
• Затем тщательно и быстро промывают водой.
• Высушивают фильтровальной бумагой.
• Наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют.

Мазок считается качественным, если бактерии расположены изолированно друг от друга и равномерно окрашены.

Негативный:

При этом методе окрашивается фон мазка, а микроорганизмы остаются неокрашенными. Он применяется для исследования микроорганизмов, оболочки которых плохо воспринимают анилиновые красители (лептоспиры, спирохеты).

• На край предметного стекла наносят каплю туши и смешивают ее петлей с каплей культуры.
• Мазок делают ребром шлифованного предметного стекла аналогично приготовлению мазка крови (см. приложение рис. 6). Предметное стекло кладут на горизонтальную поверхность и придерживают левой рукой; правой рукой к капле придвигают под углом в 45 0 шлифовальное стекло, по краю которого равномерно растекается капля; сразу же, плотно прижимая шлифовальное стекло в том же положении под углом, продвигают его налево по предметному стеклу, получая равномерный мазок.
• Дают высохнуть и микроскопируют.

Дифференциальная (сложная) окраска.

Сложные, или дифференциальные способы окраски бактерий основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки. Позволяют, применяя несколько растворов красителей и реактивов, определить морфологические свойства и структурные компоненты клетки (споры, капсулы, жгутики и др.).

Одним из важнейших методов является окрашивание микробов по Граму. Это универсальный дифференциально-диагностический метод окраски, предложенный датским ученым Грамом в 1884г. Он используется в качестве одного из ключей в определителях микробов.

Окрашивание микробов по Граму.

Грампринадлежность микробов зависит от химического состава бактериальной клетки и строения клеточной стенки.

• На фиксированный мазок кладут небольшой кусочек фильтровальной бумаги и наливают раствор генцианвиолета на 1-2 минуты.
• Снимают бумагу, сливают краску и, не промывая водой, наливают на препарат раствор Люголя на 1 минуту (мазок чернеет).
• Обработка мазка спиртом в течение 30 секунд (погружают в стаканчик 2-3 раза).
• Промывают водой.
• Дополнительно окрашивают разведенным фуксином в течение 1-2 минут.
• Сливают краску, промывают водой, обсушивают фильтровальной бумагой, исследуют с иммерсионной системой.

Грамположительные микроорганизмы окрашиваются фиолетовым цветом, не обесцвечиваются спиртом и не воспринимают основной фуксин. Грамотрицательные микроорганизмы обесцвечиваются спиртом и приобретают розово-красный цвет от окрашивания фуксином.

Обнаружение капсул методом негативного контрастирования.

Небольшое количество клеток с твердой питательной среды помещают петлей на предметное стекло в каплю разбавленного фуксина, смешивают с каплей туши, накрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом. На сером фоне препарата хорошо видны бесцветные капсулы, окружающие клетки микроорганизмов окрашены в розовый цвет.

Окраска эндоспор.

• На фиксированный мазок наливают метиленовый синий (по Леффлеру).
• Краситель доводят до кипения, держа предметное стекло пинцетом над пламенем горелки. По мере испарения красителя его добавляют. Продолжительность окраски трехкратная, по 10-15 секунд.
• Предметное стекло охлаждают и тщательно промывают водой.
• Дополнительно в течение 30 секунд докрашивают 0,5%-ным водным раствором сафранина (или фуксина Циля).
• Краситель сливают, препарат промывают водой, сушат и рассматривают под микроскопом.

При правильном окрашивании вегетативные клетки имеют красный, а споры синий цвет (светло-розовый).

5 этап: Просушивание.

Оставшуюся на стекле после промывания воду осторожно удаляют фильтровальной бумагой, или отсасывая ее краем бумаги, или слегка прижимая кусочек бумаги к мазку. Окрашенный мазок должен быть совершенно сухим, так как остаток воды образует с кедровым маслом, нанесенным на мазок, мутную эмульсию, что мешает микроскопированию.

Приготовление препаратов живых клеток микроорганизмов.

Метод изучения микробов в живом неокрашенном состоянии имеет следующие преимущества:

• Микробы изучаются в неповрежденном виде.
• Наблюдение микробов в живом виде позволяет выявить ряд свойств, не обнаруживаемых у убитых микробов (активная подвижность).

Вместе с тем метод имеет и ряд недостатков:

• Трудность исследования неокрашенных микробов ввиду их малой величины.
• Невозможность длительно сосредоточит внимание на микробе, так как он быстро перемещается из поля зрения.

В живом состоянии микробов исследуют в “раздавленной капле”, “висячей капле” и “отпечатком”, также рассматривают “агаровую пленку”; в некоторых случаях при этом применяют прижизненную (витальную) окраску микробов .

Препарат “раздавленная капля”.

На предметное стекло наносят каплю воды, помещают в нее небольшое количество клеток изучаемых микроорганизмов, размешивают и накрывают покровным стеклом. Микроорганизмы, выращенные и на плоской и в жидкой питательной среде, переносят в каплю воды бактериологической петлей; выращенные в жидкой среде можно переносить так же стерильной пипеткой. При продолжительном изучении микроскопируемого объекта края покровного стекла рекомендуется залить лаком для ногтей, что предотвратит быстрое высыхание препарата (см. приложение рис. 7).

Препарат “висячая капля”.

Каплю суспензии микроорганизмов петлей или обычным пером наносят на покровное стекло, которое поворачивают каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением (лункой) в центре. Капля должна свободно висеть, не касаясь краев и дна лунки. Края лунки предварительно смазывают вазелином. Капля оказывается герметизированной во влажной камере, что делает возможным многодневное наблюдение за объектом. Для длительных наблюдений используют стерильные стекла, а суспензию микроорганизмов готовят в жидкой питательной среде. При работе с бактериями используется редко (см. приложение рис. 8).

Препарат “отпечаток”.

Из агаризованной среды, на которой микроорганизмы растут сплошным газоном или в виде отдельных колоний, вырезают скальпелем небольшой кубик и переносят его на предметное стекло так, чтобы поверхность с микроорганизмами была обращена вверх. Затем к газону или колонии прикладывают чистое покровное стекло, слегка надавливают на него петлей или пинцетом и тот час же снимают, стараясь не сдвинуть в сторону. Полученный препарат помещают отпечатком вниз в каплю воды или метиленового синего (1:40) на предметное стекло. Отпечаток можно получить и на предметном стекле, если касаться поверхности колонии или газона предметным стеклом. Используют в основном при исследовании спороношения стрептомицетов.

Препарат “агаровая пленка” (или “микрокультура”).

На тонкое простерилизованное и нагретое предметное стекло наносят стерильной нагретой пипеткой 0,2-0,3 мл горячей агаризованной питательной среды и распределяют по всей поверхности стекла. После застывания среды удаляют петлей лишний агар, оставляя два тонких участка пленки, величиной с покровное стекло каждый. В центр квадратов бактериальной петлей или пипеткой наносят каплю жидкой культуры или суспензии клеток микроорганизма. Стекло помещают во влажную камеру (чашка Петри со слоем мокрой фильтровальной бумаги), которую ставят в термостат. Перед микрокопированием на пленку с выросшей микрокультурой наносят каплю красителя или каплю воды в случае подсыхания пленки и затем осторожно накрывают покровным стеклом .

Прижизненная окраска микробов.

При работе с раздавленной каплей для лучшей видимости микробов жидкость можно слегка подкрасить, вводя под покровное стекло небольшую каплю красителя. При этом бактерии окрасятся и будут отчетливее видны в поле зрения микроскопа.

1 способ окраски:

• На чистое предметное стекло наносят насыщенный водный раствор метиленовой сини.
• Дают высохнуть.
• Фильтровальной бумагой протирают стекло, пока налет не примет светло-голубого оттенка.
• На предметное стекло наносят каплю исследуемого материала и накрывают покровным стеклом.
• Микробы постепенно окрашиваются в голубой цвет, оставаясь живыми.

2 способ окраски:

Каплю исследуемого материала смешивают на предметном стекле с краской (0,1-0,01%), накрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом .

Таким образом, мы изучили, какие существуют способы приготовления как временных, так и постоянных микропрепаратов, из каких организмов их можно приготовить. Выяснили, что микропрепараты широко используются во всех биологических науках.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение научной и методической литературы позволило нам сделать выводы о том, что микропрепараты широко используются на уроках биологии и для этого необходимо уметь их изготовлять.

Микропрепараты делят на временные и постоянные. Временные препараты не хранятся, их готовят в ходе лабораторной работы, непосредственно перед изучением объекта. Постоянные препараты могут храниться много лет. В основном их изготавливают промышленным путем, но можно их приготовить и самостоятельно.

К микропрепаратам предъявляют определенные требования по изготовлению, хранению и использованию, которые необходимо соблюдать.

Перед занятием учитель должен проинструктировать учащихся как правильно обращаться с микропрепаратами.

Для приготовления микропрепаратов по биологии необходимы специальное оборудование и инструменты: предметные стекла, покровные стекла, пипетки, чашки Петри, различные колбы, препаровальные иглы, пинцеты, скальпели, спиртовки и др. К оборудованию, используемому при приготовлении микропрепаратов, так же как и к самим микропрепаратам предъявляются требования по хранению и подготовке, которые тоже нужно соблюдать.

Иногда, материал для микропрепаратов нужно зафиксировать и окрасить, для чего используются специальные красители и фиксаторы.

Микропрепараты можно приготовить различными способами. Это и приготовление срезов, мазков, отпечатков, и приготовление микропрепаратов живых клеток организмов (висячая капля, раздавленная капля, отпечаток, агаровая пленка) – все это временные микропрепараты. Материалом для них могут быть различные части растений, ткани, микроорганизмы.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Бавтуто Г.А. Практикум по анатомии и морфологии растений [Текст] / Г.А. Бавтуто, Л.М. Ерей. – М. : Новое издание, 2002. – 464с. : ил.
2. Микробиология [Текст] : методические рекомендации к проведению лабораторных занятий для студентов-биологов / сост. Н. В. Шарыпова.- испр., допол.- Шадринск, 2009. - 47 с., ил.
3. Практикум по анатомии и морфологии растений [Текст] : учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / В.П. Викторов, М.А. Гуленкова, Л.Н. Дорохина и др.; Под ред. Л.Н. Дорохиной. - М. : Академия, 2001. – 176 с.
4. Практикум по микробиологии [Текст] : учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захарчук и др.; Под ред. А.И. Нетрусова. – М. : Академия, 2005. – 608 с.
5. Практикум по физиологии растений [Текст] : учеб. пособие для студ. высш. пед. учеб. заведений / И.В. Плотникова, Е.А. Живухина, О.Б. Михалевская и др.; Под ред. В.Б. Иванова. – М. : Академия, 2001. – 144 с.
6. Суханова Л.В. Тетрадь для лабораторных работ (7-8 класс) [Текст] / Л.В. Суханова // 1 сентября: изд. дом 1 сентября. – 2004. – № 25-26. – С. 36-46.
7. Баринов О.Г. [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://bio.1september.ru/articlef.php?ID=200104304 . - Заглавие с экрана.
8. Википедия [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://ru.wikipedia.org/wiki/Микропрепарат - заглавие с экрана.
9. Методические рекомендации [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://freecode.pspo.perm.ru/080/work/МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНД АЦИИ. htm - заглавие с экрана.
10. http://labx.narod.ru/documents/micropreparaty.html - заглавие с экрана.
11. Микроскопическая техника в биологии [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://labx.narod.ru/documents/microscope_slides.html - заглавие с экрана.
12. Микроскопическая техника в биологии [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://labx.narod.ru/documents/prigotovlenie_micropreparatov.html - заглавие с экрана.
13. Сайт учителя биологии [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://tana.ucoz.ru/load/436-1-0-354 - заглавие с экрана.
14. Уголок России. Природа Кузбасса [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://prirodakem.narod.ru/Biblioteka/My_st/doci/kl_ob.htm - заглавие с экрана.
15. Фирма "Новый лицей" [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://novylicey.narod.ru/microprep_3_5.htm - заглавие с экрана.
16. Электронная библиотека ГАГУ(Горно-Алтайский государственный университет) [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://elib.gasu.ru/eposobia/papina/malprak1/R_1_2.html - заглавие с экрана.

Приложение

Рис. 1. Положение рук при изготовлении среза (А) и снятие срезов с бритвы (Б)

Рис. 2. Закладка объекта в сердцевину бузины.

Рис. 3. Приготовление микропрепарата.

Накрывание объекта покровным стеклом.

Рис. 4. Схема приготовления мазка крови

Рис. 5. Приготовление препарата-мазка

Рис. 6. Приготовление мазка.

Рис. 7. “Раздавленная капля”: вид сверху и сбоку

Рис. 8. “Висячая капля”: вид сверху и сбоку

Государственное бюджетное образовательное учреждение

Высшего профессионального образования

«Башкирский государственный медицинский университет»

Министерства здравоохранения и социального развития

Российской Федерации

Кафедра фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии

«9» _сентября _____2012 г.

Дисциплина Ботаника Специальность060301 Фармация

Курс1 (очное отделение) Семестр 1

Раздел: «Учение о клетке. Эргастические и секреторные вещества в растительной клетке»

Лабораторная работа № 1

На тему: «Оптические микроскопы. Особенности ботанической микротехники. Осмотические свойства растительной клетки»

Лабораторная работа № 2

На тему: «Строение клеточной стенки. Пластиды, запасные и минеральные включения»

студентов

Уфа 2012
Лабораторная работа № 1

Тема занятия: «Оптические микроскопы. Особенности ботанической микротехники. Осмотические свойства растительной клетки»

1. Актуальность. Изучение приемов ботанической микротехники является необходимым условием для усвоения практических навыков по разделу «Цитология, гистология и анатомия растений». Изучение строения растительной клетки и ее осмотических свойств дает представление о клеточной организации растительных организмов, особенностях строения и отличия от животных.

2. Цели занятия:

1. Приобрести навыки работы с микроскопом;

2. Приобрести навыки приготовления временных микропрепаратов

3. Приобрести навыки ботанической микротехники для микроскопического анализа цельного, резаного и порошкованного лекарственного растительного сырья;

4. Изучить особенности строения растительной клетки

5. Изучить свойства растительной клетки

знать :

· устройство микроскопа и правила работы с ним;

· историю изучения клетки, постулаты клеточной теории;

· строение прокариотической клетки;

· строение эукариотической клетки, ее основных органоидов;

· особенности строения растительной клетки.

Для формирования профессиональных компетенций студент должен уметь :

· приготовить микропрепарат;

· рассмотреть микропрепарат при малом и большом увеличении микроскопа;

· найти органы клетки;

· провести реакции плазмолиза и деплазмолиза, дать теоретическое обоснование;

Для формирования профессиональной компетенции студент должен владеть :

· ботаническим понятийным аппаратом;

· техникой микроскопирования и гистохимического анализа микропрепаратов растительных объектов.

3. Необходимые базисные знания и умения :

· современные представления о строении прокариотической и эукариотической клетки, их отличия.

· устройство микроскопа.

4. Продолжительность внеаудиторной работы – 2 академических часа (90 мин).

Вопросы для самоподготовки:

1. Микроскоп. Механическая и оптическая системы.

2. Правила работы с микроскопом

3. Рабочее расстояние. Разрешающая способность. Общее увеличение.

4. Клетка. История изучения. Клеточная теория

5. Отличие растительной клетки от грибной и животной

6. Строение клетки. Ядро, строение, функции.

7. Органоиды растительной клетки. Строение, функции

8. Цитоплазма. Строение, функции

9. Вакуоль, строение, функции

Пояснение к заданиям

Микроскоп.

Микроскоп - оптико-механическая система, позволяющая получать сильно увеличенное изображение предметов, размеры которых лежат далеко за пределами разрешающей способности невооруженного глаза. Разрешающая способность глаза 0,15 мм. Разрешающая способность световых микроскопов в 300-400 раз выше разрешающей способности невооруженного глаза и равна 0,1-0,3 мкм.

В микроскопе различают оптическую и механическую системы. Оптическая система состоит из осветительного аппарата, объектива и окуляра. Механическая система состоит из револьвера, тубуса, штатива, предметного столика, макро и микровинтов.

Осветительный аппарат включает в себя:

Конденсор (предназначен для наилучшего освещения, регулирования резкости изображения);

Ирисовую диафрагму (предназначена для регулирования диаметра пучка света и глубины поля зрения);

Зеркало (предназначено для направления лучей от источника света в конденсор).

Объектив представляет собой наиболее важную часть оптической системы. Объектив дает изображение объекта с обратным расположением частей. При этом он выявляет («разрешает») структуры, недоступные невооруженному глазу.

Окуляр служит для наблюдения изображения, построенного объективом. Диафрагма окуляра определяет границы поля зрения. В общем, объектив и окуляр и обеспечивают -разрешающую способность микроскопа и определяют общее увеличение микроскопа (общее увеличение микроскопа определяется, как произведение увеличения окуляра объектива).

Механическая система микроскопа предназначена для монтирования частей оптической системы.

Работа с микроскопом

1. Микроскоп установить напротив левого плеча, освободить место перед собой для альбома. Поставить объектив в рабочее положение. О правильности установки объектива следует судить по щелчку, который ощущается при вращении револьвера. Расстояние между объективом и предметным стеклом должно быть около 1 см. Работу с микроскопом всегда начинают с малого увеличения.

2. Открыть полностью диафрагму. Поднять конденсор до уровня предметного столика. Навести свет при помощи вогнутого зеркала так, чтобы все поле было освещено ярко и равномерно.

3. Приготовленный микропрепарат положить на предметный столик так, чтобы один и срезов был расположен точно под объективом. Для фиксации микропрепарата предметное стекло прижать клеммой.

4. С помощью макровинта установить необходимое фокусное расстояние для получения четкого изображения в микроскопе. Откорректировать расстояние микровинтом.

5. Перед переводом микроскопа на большее увеличение выбрать нужное место среза, поставить его в центр поля зрения, и только после этого сменить объективы путем осторожного вращения револьвера.

6. После окончания работы нужно перевести микроскоп на малое увеличение и убрать микропрепарат.

7. После работы микроскоп следует закрыть колпаком для защиты or пыли.

Методика приготовления временных микропрепаратов

1. Объект необходимо взять в левую руку и зажать тремя пальцами, в правой руке надо держать безопасную бритву или лезвие.

2. Поверхность объекта выровнять, чтобы плоскость среза была перпендикулярна оси органа. Срезы делают движением бритвы на себя.

3. На середину предметного стекла пипеткой нанести 2-3 капли воды и на кончике препаровальной иглы перенести наиболее тонкие срезы, закрыть объект покровным стеклом. Жидкость не должна вытекать из-под покровного стекла.

4. Приготовленный препарат положить на предметный столик, рассмотреть при малом и большом увеличениях.

5. Кроме временных препаратов, для исследования объектов используют постоянные препараты. Включающей жидкостью в них является глицерин с желатиной или канадский бальзам.

6. При окрашивании препарата следует учесть, что под действием концентрированных кислот органические включения в клетке могут обуглиться, минеральные включения (кристаллы, друзы, цистолиты) - совсем исчезнуть или изменить свою форму.

7. Нельзя вынимать препарат из-под объектива х40, т.к,. рабочее расстояние его равно 0,6 мм и легко можно испортить фронтальную линзу.

Клетка

Клетка - основная структурная и функциональная единица всего живого. Клетки впервые описал Роберт Гук в середине семнадцатого века (1665 г), рассматривая кусочек пробки. Знания о клетке расширялись с усовершенствованием микроскопа. К середине девятнадцатого века было накоплено достаточно знаний о клетке - открытие ядра, пластид, деления клеток и др. Все знания о клетке были обобщены на рубеже 30-40х г. 19 века ботаником М. Шлейденом и зоологом Т.Шванном в виде клеточной теории.

Главные тезисы (постулаты) клеточной теории:

1. клетка - структурная и функциональная единица всего живого;

2. многоклеточный организм - это сложно организованная, интегрированная система, состоящая из функционирующих и взаимодействующих клеток;

3. все клетки гомологичны по строению;

4. «клетка от клетки». Принцип преемственности клеток путем деления былобоснован в 1958 г. немецким ученым Р. Вирховым.

Форма, строение и размеры клеток очень разнообразны. Растительная клетка состоит из протопласта, оболочки или клеточной стенки и вакуоли .

Протопласт включает: цитоплазму, ядро, пластиды, митохондрии .

Цитоплазма - часть протопласта, заключенная между плазмаллемой и ядром. Основу цитоплазмы составляет ее матрикс, или гиалоплазма – сложная, бесцветная коллоидная система. Важнейшая роль гиалоплазмы заключается в объединении всех клеточных структур в единую систему, обеспечении взаимодействия между ними в процессах клеточного метаболизма. В цитоплазме осуществляется большая часть процессов клеточного метаболизма, кроме синтеза нуклеиновых кислот.

Ядро - обязательная и главная часть живой клетки всех эукариотов. Функции ядра: хранение и воспроизводство наследственной информации, управление обменом веществ и почти всех процессов, происходящих в клетке, синтез нуклеиновых кислот, синтез белка. Ядро окружено оболочкой, состоящей из двух мембран, несущих очень крупные поры. Внутреннее содержимое ядра называется ядерным соком, или нуклеоплазмой. В ядерный сок погружены одно или несколько ядрышек.

Митохондрии органоиды клетки, форма, величина и число которых – постоянно меняются. Основная функция - обеспечение энергетических потребностей клетки путем окисления энергетически богатых веществ (сахаров) и синтеза АТФ и АДФ. Митохондрии окружены двумя мембранами, внутренняя образует выросты - кристы. Митохондрии, как и пластиды, являются полуавтономными органоидами, т.к. содержат в матриксе ДНК и рибосомы.

Пластиды характерны только для растений. Различают три типа пластид: хлоропласты, хромопласты и лейкопласты . Основная функция хлоропластов – фотосинтез, лейкопластов -запасание питательных веществ и хромопластов - окраска цветов и плодов. Хлоропласты состоят из двойной мембраны, матрикса, тиллакоидов, объединенных в граны, ДНК, рибосом, зерен первичного крахмала.

Комплекс Гольджи - система дисковидных мешочков и пузырьков, окруженных мембранами. Выполняет функции синтеза, накопления и выделения некоторых полисахаридов (пектинов, слизей и др.), вторичных метаболитов; образования вакуолей и лизосом; распределения и внутриклеточного транспорта некоторых белков; участвует в построении цитоплазматической мембраны.

ЭПС (эндоплазматическая сеть) – ограниченная мембранами система субмикроскопических каналов. ЭПС подразделяется на гладкую и шероховатую. Функции шероховатой ЭПС: синтез белков; направленный транспорт макромолекул и ионов; образование мембран; взаимодействие органелл. Функция гладкой ЭПС - синтез липофильных соединений.

Вакуоль - полость в клетке, окруженная мембраной (тонопластом), и заполненная клеточным соком. Клеточный сок представляет собой водный раствор различных веществ – продуктов жизнедеятельности протопласта. Функции вакуолей: накопление запасных веществ и шлаков; поддержание тургора клетки; регуляция водно-солевого баланса клетки.

Клеточная стенка отделяет клетку от окружающей среды. Основу ее составляют молекулы целлюлозы, которые сгруппированы в микрофибриллы и фибриллы. Молекулы целлюлозы погружены в матрикс, который состоит из полисахаридов, имеющих более разветвленную структуру - гемицеллюлоз и пектинов, а также воды. Клеточная стенка очень прочная, и в то же время, эластичная. Прочность ей придают молекулы целлюлозы, эластичность - матрикс. Клеточная стенка выполняет формообразующую и механическую функции, обеспечивает защиту протопласта, противостоит высокому осмотическому давлению вакуоли, через клеточную стенку происходит транспорт веществ.

»: Повышенный уровень лейкоцитов, бактериальная инфекция, картофель содержит крахмал, насекомые переносят заболевания — эти и другие похожие высказывания приходится слышать отовсюду. Каждый день с экранов телевизоров, из уст знакомых, с полос газет и журналов нам в мозг поступает одна и та же информация. Информация, которая, как может показаться, является уделом лишь специалистов — медиков и биологов. Ведь именно они касаются этих вопросов в своей повседневной жизни. Простому же человеку достаются лишь только выводы из тех или иных исследований, сухие слова, не обладающие наглядностью. В этой статье я постараюсь рассказать просто о сложном. О том, как каждый может приблизить к себе неуловимый, на первый взгляд, мир клеток и микроорганизмов.

Вот уже два года, как я наблюдаю за этим миром у себя дома, и год, как делаю фотоснимки. За это время я успел увидеть собственными глазами, какие бывают клетки крови, что опадает с крыльев бабочек и молей, как бьётся сердце у улитки. Конечно, многое можно было бы почерпнуть из учебников, видеолекций и с тематических веб-сайтов. Единственное, что осталось бы не почерпнутым - это ощущение присутствия и близости к тому, чего не видно невооружённым глазом. То, что прочитано в книге или увидено в телепередаче, скорее всего, сотрется из памяти в весьма сжатые сроки. Что увидено лично в объектив микроскопа - останется с тобой навсегда. И останется не столько сам образ увиденного, сколько понимание, что мир устроен именно так, а не иначе. Что это не просто слова из книжки, а личный опыт. Опыт, который в наше время доступен каждому.

Что купить?

Театр начинается с вешалки, а исследование - с покупки оборудования. В нашем случае это будет микроскоп, ибо в лупу много не разглядишь. Из основных характеристик микроскопа «для домашних нужд» стоит выделить, конечно же, набор доступных увеличений, которые определяются произведением увеличений окуляра и объектива. Не всякий биологический образец хорош для исследования на больших увеличениях. Связано это с тем, что большее увеличение оптической системы предполагает меньшую глубину резкости. Следовательно, изображение неровных поверхностей препарата частично будет размыто. Поэтому важно иметь набор объективов и окуляров , позволяющий вести наблюдения во всем диапазоне увеличения: 10–20×, 40–60×, 100–200×, 400–600×, 900–1000×. Иногда бывает оправдано увеличение 1500×, достигающееся при покупке окуляра 15× и объектива 100×. Всё, что увеличивает сильнее, разрешающей способности заметно не прибавит, так как на увеличениях около 2000–2500× уже близок так называемый «оптический предел », обусловленный дифракционными явлениями.

Следующим немаловажным моментом является тип насадки. Обычно выделяют монокулярную, бинокулярную и тринокулярную разновидности. Принцип классификации основывается на том, «сколькими глазами» вы хотите смотреть на объект. В случае монокулярной системы вам придётся щуриться, постоянно меняя глаза от усталости при длительном наблюдении. Здесь вам на помощь придёт бинокулярная насадка, в которую, как и следует из её названия, можно глядеть обоими глазами. В целом, это более благоприятно скажется на самочувствии ваших глаз. Не следует путать бинокуляр со стереомикроскопом. Последний позволяет добиться объёмного восприятия наблюдаемого объекта за счёт наличия двух объективов, в то время как бинокулярные микроскопы просто подают на оба глаза одно и то же изображение. Для фото- и видеосъёмки микрообъектов понадобится «третий глаз», а именно насадка для установки камеры. Многие производители выпускают специальные камеры для своих моделей микроскопов, хотя можно использовать и обычный фотоаппарат (правда, при этом придётся купить переходник).

Наблюдение при больших увеличениях требует хорошего освещения в силу небольшой апертуры соответствующих объективов. Канули те времена, когда препарат исследовали в отражённом от зеркала свете. Сейчас микроскопы представляют собой комплексные оптико-механо-электрические приборы, в которых всецело используются достижения научно-технического прогресса. В современных устройствах имеется своя лампочка, свет от которой распространяется через специальное устройство - конденсор , - которое и освещает препарат. В зависимости от типа конденсора можно выделить различные способы наблюдения, самыми популярными из которых являются методы светлого и тёмного поля. Первый метод, знакомый многим ещё со школы, предполагает, что препарат освещается равномерно снизу. При этом в тех местах, где препарат оптически прозрачен, свет распространяется от конденсора в объектив, а в непрозрачной среде свет поглощается, приобретает окраску и рассеивается. Поэтому на белом фоне получается тёмное изображение - отсюда и название метода.

С темнопольным конденсором всё иначе. Он устроен так, что лучи света, выходящие из него, направлены в разные стороны, кроме непосредственно отверстия объектива. Поэтому они проходят сквозь оптически прозрачную среду, не попадая в поле зрения наблюдателя. С другой стороны, лучи, попавшие на непрозрачный объект, рассеиваются на нём во все стороны, в том числе и в направлении объектива. Поэтому в итоге на тёмном фоне будет виден светлый объект. Такой метод наблюдения хорош для исследования прозрачных объектов, которые на светлом фоне не являются контрастными. По умолчанию большинство микроскопов являются светлопольными. Поэтому, если вы планируете расширить набор методов наблюдения, то стоит выбирать модели микроскопов, в которых предусмотрена установка дополнительного оборудования: конденсоров, устройств фазового контраста, поляризаторов и т.п.

Как известно, оптические системы не идеальны: прохождение света через них сопряжено с искажениями изображения - аберрациями . Поэтому объективы и окуляры стараются изготавливать так, чтобы эти аберрации максимально устранить. Всё это сказывается на их конечной стоимости. Из соображений цены и качества имеет смысл покупать планахроматические объективы. Они используются при профессиональных исследованиях и имеют адекватную цену. Объективы с большим увеличением (например, 100×) имеют числовую апертуру больше 1, что предполагает использование масла при наблюдении - так называемая иммерсия . Поэтому, если кроме «сухих» объективов вы берёте ещё и иммерсионные, стоит заранее позаботиться об иммерсионном масле. Его показатель преломления обязательно должен соответствовать вашему конкретному объективу.

Конечно, это не весь список параметров, которые следует учитывать при покупке микроскопа. Иногда бывает важно обратить внимание на устройство и расположение предметного столика и рукояток для управления им. Стоит выбрать и тип осветителя, которым может быть как обычная лампа накаливания, так и светодиод, который светит ярче и греется меньше. Также микроскопы могут иметь индивидуальные особенности. Но основное, что стоило бы сказать об их устройстве, пожалуй, сказано. Каждая дополнительная опция - это добавка к цене, поэтому выбор модели и комплектации - это удел конечного потребителя.

В последнее время наметилась тенденция покупки микроскопов для детей. Такие устройства обычно являются монокулярами с небольшим набором объективов и скромными параметрами, стоят недорого и могут послужить хорошей отправной точкой не только для непосредственно наблюдений, но и для ознакомления с основными принципами работы микроскопа. После этого ребёнку уже можно будет купить более серьёзное устройство на основании выводов, сделанных при работе с «бюджетной» моделью.

Как смотреть?

Любительское наблюдение не предполагает исключительных навыков ни в работе с микроскопом, ни в подготовке препаратов. Конечно, можно купить далеко не дешёвые наборы уже готовых препаратов, но тогда не таким ярким будет ощущение вашего личного присутствия в исследовании, да и готовые препараты рано или поздно наскучат. Поэтому, купив микроскоп, стоит задуматься о реальных объектах для наблюдения. Кроме того, вам понадобятся хоть и специальные, но доступные средства для подготовки препаратов.

Наблюдение в проходящем свете предполагает, что исследуемый объект является достаточно тонким. Даже не каждая кожура с ягоды или фрукта сама по себе обладает необходимой толщиной, поэтому в микроскопии исследуют срезы. В домашних условиях достаточно адекватные срезы можно делать обычными лезвиями для бритья. При определённой сноровке можно достигнуть толщины среза в несколько клеточных слоёв, что во многом повысит дифференцируемость объектов препарата. В идеале стоит работать с моноклеточным слоем ткани, ибо несколько слоёв клеток, наложенных друг на друга, создают нечёткое и сумбурное изображение.

Исследуемый препарат помещается на стекло предметное и, в случае необходимости, накрывается стеклом покровным. Поэтому, если в комплекте к микроскопу стёкла не прилагаются, их следует купить отдельно. Сделать это можно в ближайшем магазине медицинской техники. Однако не каждый препарат хорошо прилегает к стеклу, поэтому применяют методы фиксации. Основными являются фиксация огнём и спиртом. Первый метод требует определённого навыка, так как можно попросту «спалить» препарат. Второй способ зачастую более оправдан. Чистый спирт достать не всегда возможно, поэтому в аптеке в качестве заменителя можно приобрести антисептик, который, по сути, является спиртом с примесями. Там же стоит купить йод и зелёнку. Эти привычные для нас средства дезинфекции на деле оказываются ещё и хорошими красителями для препаратов. Ведь не всякий препарат открывает свою сущность при первом взгляде. Иногда ему нужно «помочь», подкрасив его форменные элементы: ядро, цитоплазму, органеллы.

Для взятия образцов крови следует приобрести скарификаторы, пипетки и вату. Всё это есть в продаже в медицинских магазинах и аптеках. Кроме того, для сбора объектов из дикой природы следует запастись маленькими пакетиками и баночками. Брать с собой баночку для набора воды из ближайшего водоёма при выезде на природу должно стать у вас хорошей привычкой.

Что смотреть?

Микроскоп приобретён, инструменты закуплены - пора начинать. И начать следует с самого доступного. Что может быть доступнее кожуры репчатого лука (рис. 1 и 2)? Являясь тонкой сама по себе, кожура лука, будучи подкрашенной йодом, обнаруживает в своём строении чётко дифференцируемые ядра. Этот опыт, хорошо знакомый со школы, пожалуй, и стоит провести первым. Саму кожуру лука нужно залить йодом и оставить окрашиваться на 10–15 минут, после чего нужно промыть её под струёй воды.

Кроме того, йод можно использовать для окраски картофеля (рис. 3). Не стоит забывать, что срез необходимо делать как можно более тонким. Буквально 5–10 минут пребывания среза картофеля в йоде проявят пласты крахмала, которые окрасятся в синий цвет. Йод является достаточно универсальным красителем. Им можно окрашивать широкий спектр препаратов.

Рисунок 1. Кожица лука (увеличение: 1000×). Окраска йодом. На фотографии дифференцируется ядро в клетке.

Рисунок 2. Кожица лука (увеличение: 1000×). Окраска Азур-Эозином. На фотографии в ядре дифференцируется ядрышко.

Рисунок 3. Зерна крахмала в картофеле (увеличение: 100×). Окраска йодом.

На балконах жилых домов часто скапливается большое количество трупов летающих насекомых. Не торопитесь от них избавляться: они могут послужить ценным материалом для исследования. Как видно из фотографий, вы обнаружите, что крылья насекомых волосатые (рис. 4–6). Насекомым это необходимо для того, чтобы крылья не намокали . В силу большого поверхностного натяжения, капли воды не могут «провалиться» сквозь волоски и коснуться крыла.

Это явление называется гидрофобностью . Подробно мы о нем говорили в статье «Физическая водобоязнь ». - Ред.

Рисунок 4. Крыло божьей коровки (увеличение: 400×).

Рисунок 5. Крыло бибионида (увеличение: 400×).

Рисунок 6. Крыло бабочки боярышницы (увеличение: 100×).

Если вы когда-нибудь задевали крыло бабочки или моли, то, наверное, замечали, что с неё слетает какая-то «пыль». На фотографиях отчётливо видно, что этой пылью являются чешуйки с их крыльев (рис. 7). Они имеют разную форму и достаточно легки на отрыв.

Кроме того, можно поверхностно изучить строение конечностей членистоногих (рис. 8), рассмотреть хитиновые плёнки - например, на спине таракана (рис. 9). При должном увеличении можно убедиться, что такие плёнки состоят из плотно прилегающих (возможно, сросшихся) чешуек.

Рисунок 7. Чешуйки с крыльев моли (увеличение: 400×).

Рисунок 8. Конечность паука (увеличение: 100×).

Рисунок 9. Плёнка на спине таракана (увеличение: 400×).

Следующее, что стоило бы понаблюдать - это кожура ягод и фруктов (рис. 10 и 11). Не все фрукты и ягоды обладают приемлемой для наблюдения в микроскоп кожурой. Либо её клеточное строение может быть не дифференцируемым, либо толщина не позволит добиться чёткого изображения. Так или иначе, придётся сделать немало попыток, прежде чем вы получите хороший препарат. Вам придётся перебрать разные сорта винограда - например, для того, чтобы найти тот, у которого красящие вещества в кожуре имели бы «приятную для глаза» форму, или сделать несколько срезов кожицы сливы, пока не добьётесь моноклеточного слоя. В любом случае, вознаграждение за проделанную работу будет достойным.

Рисунок 10. Кожура чёрного винограда (увеличение: 1000×).

Рисунок 11. Кожура сливы (увеличение: 1000×).

Рисунок 12. Лист клевера (увеличение: 100×). Некоторые клетки содержат тёмнокрасный пигмент.

Достаточно доступным для исследования объектом является зелень: трава, водоросли, листья (рис. 12 и 13). Но, несмотря на повсеместную распространённость, выбрать и приготовить хороший образец бывает не так-то просто.

Самым интересным в зелени являются, пожалуй, хлоропласты (рис. 14 и 15). Поэтому срез должен быть исключительно тонким. Нередко приемлемой толщиной обладают зелёные водоросли, встречающиеся в любых открытых водоёмах.

Рисунок 13. Лист земляники (увеличение: 40×).Рисунок 16. Плавающая водоросль со жгутиком (увеличение: 400×).

Рисунок 17. Детёныш улитки (увеличение: 40×).

Рисунок 18. Мазок крови. Окраска Азур-Эозином по Романовскому (увеличение: 1000×). На фотографии эозинофил на фоне эритроцитов.

Сам себе учёный

Видео 1. Биение сердца улитки (увеличение оптического микроскопа 100×).

После исследования простых и доступных препаратов естественным желанием является усложнение техник наблюдения и расширение класса изучаемых объектов. Для этого, во-первых, понадобится литература по специальным методам исследования, а, во-вторых, специальные средства. Эти средства, хотя и являются своими для каждого типа объектов, всё-таки обладают некоторой общностью и универсальностью. Например, всеобще известный метод окраски по Граму, когда разные виды бактерий после окраски дифференцируются по цветам, может быть применён и при окраске других, не бактериальных, клеток. Близким к нему по сути является и метод окраски мазков крови по Романовскому. В продаже имеется как уже готовый жидкий краситель, так и порошок, состоящий из таких красящих веществ, как азур и эозин. Все красители можно купить в специализированных медико-биологических магазинах, либо заказать в интернете. Если же по каким-то причинам вы не можете достать краситель для крови, можно попросить лаборанта, делающего вам анализ крови в больнице, приложить к анализу стёклышко с окрашенным мазком вашей крови.

Продолжая тему исследования крови, нельзя не упомянуть камеру Горяева - устройство для подсчёта форменных элементов крови. Будучи важным инструментом для оценки количества эритроцитов в крови ещё в те времена, когда не было устройств для автоматического анализа её состава, камера Горяева также позволяет измерять размеры объектов благодаря нанесённой на неё разметке с известными размерами делений. Методы исследования крови и других жидкостей с помощью камеры Горяева описаны в специальной литературе.

Заключение

В данной статье я постарался рассмотреть основные моменты, связанные с выбором микроскопа, подручных средств и основные классы объектов для наблюдения, которые нетрудно встретить в быту и на природе. Как уже было сказано, специальные средства наблюдения предполагают наличие хотя бы начальных навыков работы с микроскопом, поэтому их обзор выходит за рамки данной статьи. Как видно из фотографий, микроскопия может стать приятным хобби, а может быть, для кого-то даже и искусством.

В современном мире, где разнообразные технические средства и устройства находятся в шаговой доступности, каждый сам решает, на что ему потратить собственные деньги. Из развлекательных соображений это может быть дорогостоящий ноутбук или телевизор с запредельным размером диагонали. Но находятся и те, кто отводит свой взор от экранов и направляет его либо далеко в космос, приобретая телескоп, либо, смотря в окуляр микроскопа, проникают взглядом глубоко внутрь. Внутрь той природы, частью которой мы являемся.

Литература

1. Ландсберг Г.С. (2003). Оптика. § 92 (стр. 301);
2. Гуревич А.А. (2003). Пресноводные водоросли;
3. Козинец Г.И. (1998). Атлас клеток крови и костного мозга;
4. Коржевский Д.Э. (2010). Основы гистологичесой техники..

Станислав Яблоков, Ярославский государственный университет им. П. Г. Демидова

Вот уже два года, как я наблюдаю за микромиром у себя дома, и год, как снимаю его на фотокамеру. За это время собственными глазами увидел, как выглядят клетки крови, чешуйки, опадающие с крыльев бабочек, как бьётся сердце улитки. Конечно, многое можно было бы узнать из учебников, видеолекций и тематических сайтов. Но при этом не было бы ощущения присутствия, близости к тому, что не видно невооружённым глазом. Что это не просто слова из книжки, а личный опыт. Опыт, который сегодня доступен каждому.

Кожица лука. Увеличение 1000×. Окраска йодом. На фотографии видно клеточное ядро.

Кожица лука. Увеличение 1000×. Окраска азур-эозином. На фотографии в ядре заметно ядрышко.

Картофель. Синие пятна - зёрна крахмала. Увеличение 100×. Окраска йодом.

Плёнка на спине таракана. Увеличение 400×.

Кожура сливы. Увеличение 1000×.

Крыло жучка бибиониды. Увеличение 400×.

Крыло бабочки боярышницы. Увеличение 100×.

Чешуйки с крыльев моли. Увеличение 400×.

Хлоропласты в клетках травы. Увеличение 1000×.

Детёныш улитки. Увеличение 40×.

Лист клевера. Увеличение 100×. Некоторые клетки содержат тёмно-красный пигмент.

Лист земляники. Увеличение 40×.

Хлоропласты в клетках водоросли. Увеличение 1000×.

Мазок крови. Окраска азур-эозином по Романовскому. Увеличение 1000×. На фотографии: эозинофил на фоне эритроцитов.

Мазок крови. Окраска азур-эозином по Романовскому. Увеличение 1000×. На фотографии: слева - моноцит, справа - лимфоцит.

Что купить

Театр начинается с вешалки, а микросъёмка с покупки оборудования, и прежде всего - микроскопа. Одна из основных его характеристик - набор доступных увеличений, которые определяются произведением увеличений окуляра и объектива.

Не всякий биологический образец хорош для просмотра при большом увеличении. Связано это с тем, что чем больше увеличение оптической системы, тем меньше глубина резкости. Следовательно, изображение неровных поверхностей препарата частично будет размыто. Поэтому важно иметь набор объективов и окуляров, позволяющий вести наблюдения с увеличением от 10-20 до 900-1000×. Иногда бывает оправданно добиться увеличения 1500× (окуляр 15 и объектив 100×). Большее увеличение бессмысленно, так как более мелкие детали не позволяет видеть волновая природа света.

Следующий немаловажный момент - тип окуляра. «Сколькими глазами» вы хотите рассматривать изображение? Обычно выделяют монокулярную, бинокулярную и тринокулярную его разновидности. В случае монокуляра придётся щуриться, утомляя глаз при длительном наблюдении. В бинокуляр смотрят обоими глазами (не следует путать его со стереомикроскопом, дающим объёмное изображение). Для фото- и видеосъёмки микрообъектов понадобится «третий глаз» - насадка для установки аппаратуры. Многие производители выпускают специальные камеры для своих моделей микроскопов, но можно использовать и обычный фотоаппарат, купив к нему переходник.

Наблюдение при больших увеличениях требует хорошего освещения в силу небольшой апертуры объективов. Световой пучок от осветителя, преобразованный в оптическом устройстве - конденсоре, освещает препарат. В зависимости от характера освещения существует несколько способов наблюдения, самые распространённые из которых - методы светлого и тёмного поля. В первом, самом простом, знакомом многим ещё со школы, препарат освещают равномерно снизу. При этом через оптически прозрачные детали препарата свет распространяется в объектив, а в непрозрачных он поглощается и рассеивается. На белом фоне получается тёмное изображение, отсюда и название метода. С тёмнопольным конденсором всё иначе. Световой пучок, выходящий из него, имеет форму конуса, лучи в объектив не попадают, а рассеиваются на непрозрачном препарате, в том числе и в направлении объектива. В итоге на тёмном фоне виден светлый объект. Такой метод наблюдения хорош для исследования прозрачных малоконтрастных объектов. Поэтому, если вы планируете расширить набор методов наблюдения, стоит выбирать модели микроскопов, в которых предусмотрена установка дополнительного оборудования: конденсора тёмного поля, тёмнопольной диафрагмы, устройств фазового контраста, поляризаторов и т.п.

Оптические системы не идеальны: прохождение света через них сопряжено с искажениями изображения - аберрациями. Поэтому объективы и окуляры стараются изготавливать так, чтобы эти аберрации максимально устранить. Всё это сказывается на их конечной стоимости. Из соображений цены и качества имеет смысл покупать планахроматические объективы для профессиональных исследований. Сильные объективы (с увеличением, например, 100×) имеют числовую апертуру больше 1 при использовании иммерсии, масла с высоким показателем преломления, раствора глицерина (для УФ-области) или просто воды. Поэтому, если кроме «сухих» объективов вы берёте ещё и иммерсионные, стоит заранее позаботиться об иммерсионной жидкости. Её показатель преломления обязательно должен соответствовать конкретному объективу.

Иногда следует обратить внимание на устройство предметного столика и рукояток для управления им. Стоит выбрать и тип осветителя, которым может быть как обычная лампа накаливания, так и светодиод, который ярче и греется меньше. Микроскопы тоже имеют индивидуальные особенности. Каждая дополнительная опция - это добавка в цене, поэтому выбор модели и комплектации остаётся за потребителем.

Сегодня нередко покупают недорогие микроскопы для детей, монокуляры с небольшим набором объективов и скромными параметрами. Они могут послужить хорошей отправной точкой не только для исследования микромира, но и для ознакомления с основными принципами работы микроскопа. После этого ребёнку уже стоит купить более серьёзное устройство.

Как смотреть

Можно купить далеко не дешёвые наборы готовых препаратов, но тогда не таким ярким будет ощущение личного участия в исследовании, да и наскучат они рано или поздно. Поэтому следует позаботиться и об объектах для наблюдения, и о доступных средствах для подготовки препаратов.

Наблюдение в проходящем свете предполагает, что исследуемый объект достаточно тонок. Даже кожура ягоды или фрукта слишком толста, поэтому в микроскопии исследуют срезы. В домашних условиях их делают обычными бритвенными лезвиями. Чтобы не смять кожуру, её помещают между кусочками пробки или заливают парафином. При определённой сноровке можно достигнуть толщины среза в несколько клеточных слоёв, а в идеале следует работать с моноклеточным слоем ткани - несколько слоёв клеток создают нечёткое сумбурное изображение.

Исследуемый препарат помещают на предметное стекло и в случае необходимости закрывают покровным. Купить стёкла можно в магазине медицинской техники. Если препарат плохо прилегает к стеклу, его фиксируют, слегка смачивая водой, иммерсионным маслом или глицерином. Не всякий препарат сразу открывает свою структуру, иногда ему нужно «помочь», подкрасив его форменные элементы: ядра, цитоплазму, органеллы. Неплохими красителями служат йод и «зелёнка». Йод достаточно универсальный краситель, им можно окрашивать широкий спектр биологических препаратов.

При выезде на природу следует запастись баночками для набора воды из ближайшего водоёма и маленькими пакетиками для листьев, высохших остатков насекомых и т.п.

Что смотреть

Микроскоп приобретён, инструменты закуплены - пора начинать. И начать следует с самого доступного - например, кожуры репчатого лука. Тонкая сама по себе, подкрашенная йодом, она обнаруживает в своём строении чётко различимые клеточные ядра. Этот опыт, хорошо знакомый со школы, и стоит провести первым. Луковую кожуру нужно залить йодом на 10-15 минут, после чего промыть под струёй воды.

Кроме того, йод можно использовать для окраски картофеля. Срез необходимо сделать как можно более тонким. Буквально 5-10 минут его пребывания в йоде проявят пласты крахмала, который окрасится в синий цвет.

На балконах часто скапливается большое количество трупиков летающих насекомых. Не торопитесь от них избавляться: они могут послужить ценным материалом для исследования. Как видно из фотографий, вы обнаружите, что на крыльях насекомых есть волоски, которые защищают их от намокания. Большое поверхностное натяжение воды не позволяет капле «провалиться» сквозь волоски и коснуться крыла.

Если вы когда-нибудь задевали крыло бабочки или моли, то, наверное, замечали, что с неё слетает какая-то «пыль». На снимках отчётливо видно, что это не пыль, а чешуйки с крыльев. Они имеют разную форму и довольно легко отрываются.

Кроме того, с помощью микроскопа можно изучить строение конечностей насекомых и пауков, рассмотреть, например, хитиновые плёнки на спине таракана. И при должном увеличении убедиться, что такие плёнки состоят из плотно прилегающих (возможно, сросшихся) чешуек.

Не менее интересный объект для наблюдения - кожура ягод и фруктов. Однако либо её клеточное строение может быть неразличимым, либо её толщина не позволит добиться чёткого изображения. Так или иначе, придётся сделать немало попыток, прежде чем получится хороший препарат: перебрать разные сорта винограда, чтобы найти тот, у которого красящие вещества кожуры имели бы интересную форму, или сделать несколько срезов кожицы сливы, добиваясь моноклеточного слоя. В любом случае вознаграждение за проделанную работу будет достойным.

Ещё более доступны для исследования трава, водоросли, листья. Но, несмотря на повсеместную распространённость, выбрать и приготовить из них хороший препарат бывает непросто. Самое интересное в зелени - это, пожалуй, хлоропласты. Поэтому срез должен быть исключительно тонким.

Приемлемой толщиной нередко обладают зелёные водоросли, встречающиеся в любых открытых водоёмах. Там же можно найти плавучие водоросли и микроскопических водных обитателей - мальков улитки, дафний, амёб, циклопов и туфелек. Маленький детёныш улитки, оптически прозрачный, позволяет разглядеть у себя биение сердца.

Сам себе исследователь

После изучения простых и доступных препаратов захочется усложнить технику наблюдения и расширить класс исследуемых объектов. Для этого понадобится и специальная литература, и специализированные средства, свои для каждого типа объектов, но всё-таки обладающие некоторой универсальностью. Например, метод окраски по Граму, когда разные виды бактерий начинают различаться по цвету, можно применить и для других, не бактериальных, клеток. Близок к нему и метод окраски мазков крови по Романовскому. В продаже имеется как уже готовый жидкий краситель, так и порошок, состоящий из его компонентов - азура и эозина. Их можно купить в специализированных магазинах либо заказать в интернете. Если раздобыть краситель не удастся, можно попросить у лаборанта, делающего вам анализ крови в поликлинике, стёклышко с окрашенным её мазком.

Продолжая тему исследования крови, следует упомянуть камеру Горяева - устройство для подсчёта количества клеток крови и оценки их размеров. Методы исследования крови и других жидкостей с помощью камеры Горяева описаны в специальной литературе.

В современном мире, где разнообразные технические средства и устройства находятся в шаговой доступности, каждый сам решает, на что ему потратить деньги. Это может быть дорогостоящий ноутбук или телевизор с запредельным размером диагонали. Находятся и те, кто отводит свой взор от экранов и направляет его далеко в космос, приобретая телескоп. Микроскопия может стать интересным хобби, а для кого-то даже и искусством, средством самовыражения. Глядя в окуляр микроскопа, проникают глубоко внутрь той природы, часть которой мы сами.

«Наука и жизнь» о микросъёмке:

Микроскоп «Аналит» - 1987, № 1.

Ошанин С. Л. С микроскопом у пруда. - 1988, № 8.

Ошанин С. Л. Невидимая миру жизнь. - 1989, № 6.

Милославский В. Ю. . - 1998, № 1.

Мологина Н. . - 2007, № 4.

Словарик к статье

Апертура - действующее отверстие оптической системы, определяемое размерами зеркал, линз, диафрагм и других деталей. Угол α между крайними лучами конического светового пучка называется угловой апертурой. Числовая апертура А = n sin(α/2), где n - показатель преломления среды, в которой находится объект наблюдения. Разрешающая способность прибора пропорциональна А, освещённость изображения А 2 . Чтобы увеличить апертуру, применяют иммерсию.

Иммерсия - прозрачная жидкость с показателем преломления n > 1. В неё погружают препарат и объектив микроскопа, увеличивая его апертуру и тем самым повышая разрешающую способность.

Планахроматический объектив - объектив с исправленной хроматической аберрацией, который создаёт плоское изображение по всему полю. Обычные ахроматы и апохроматы (аберрации исправлены для двух и для трёх цветов соответственно) дают криволинейное поле, которое исправить невозможно.

Фазовый контраст - метод микроскопических исследований, основанный на изменении фазы световой волны, прошедшей сквозь прозрачный препарат. Фаза колебания не видна простым глазом, поэтому специальная оптика - конденсор и объектив - превращает разность фаз в негативное или позитивное изображение.

Моноциты - одна из форм белых клеток крови.

Хлоропласты - зелёные органеллы растительных клеток, отвечающие за фотосинтез.

Эозинофилы - клетки крови, играющие защитную роль при аллергических реакциях.